影響PCR實驗的因素之一、PCR耗材

　　在PCR實驗中，影響擴(kuò)增效果的因素有很多。我們能想到的有dNTP的質(zhì)量與濃度、模板核酸的量與純化程度、引物的設(shè)計、DNA聚合酶的濃度、擴(kuò)增長度等問題。

　　實際上，使用的耗材也可能會影響實驗結(jié)果，而這往往被我們所忽略。因此在選擇實驗耗材前，我們還需要了解BUNSEN本生PCR耗材相關(guān)的特性和術(shù)語。

　　如何選擇合適的PCR耗材，本生簡述：

　　1、原材料

　　PCR/qPCR耗材一般都是聚丙烯(PP)材質(zhì)。

　　因其為生物學(xué)惰性材料，表面不易粘附生物分子，且有著良好的化學(xué)耐性，及溫度耐受性 (可121℃高壓滅菌，也可以承受熱循環(huán)過程中的溫度變化)。這些材料通常會與試劑或者樣品直接接觸，因而在生產(chǎn)制備過程中需要選用高質(zhì)量的材料和良好的加工工藝。

　　2、選擇合適的容積

　　PCR管的體積規(guī)格大多數(shù)都可以滿足PCR反應(yīng)要求。但是在滿足實驗要求的基礎(chǔ)上，優(yōu)先推薦選用低容管。因為低容反應(yīng)管/板有著較小的上方空間，可提高熱傳導(dǎo)率并降低蒸發(fā)。而且在加樣時，需要避免加樣過量或過少。過量會導(dǎo)致熱傳導(dǎo)率下降，溢出及交叉污染，而加樣過少可能會造成樣品蒸發(fā)損失。

　　大家可依據(jù)具體的實驗要求選用合適的產(chǎn)品：

　　3、PCR管管蓋的選擇

　　平蓋與凸蓋各有優(yōu)勢：

　　平蓋可為qPCR提供精確的熒光信號傳遞;便于書寫標(biāo)記;合蓋容易，密封性好，易于操作。

　　凸蓋與PCR儀熱蓋接觸，減少壓力引起的反應(yīng)管變形，更好的防止液體蒸發(fā)。但會影響熒光信號傳遞，無法應(yīng)用于qPCR實驗。

　　4、96孔板裙邊的選擇

　　無裙邊板：可適用于大多數(shù)的PCR儀或qPCR儀，但不適用于自動化、應(yīng)用。移液過程中穩(wěn)定性不高，需要配合板托使用。

　　半裙邊板：可適配標(biāo)簽或應(yīng)用條碼，適合自動化應(yīng)用，且有著較好的移液穩(wěn)定性。

　　全裙邊板：非常適用于自動化實驗應(yīng)用，也可適配標(biāo)簽及應(yīng)用條碼。機(jī)械強(qiáng)度較好，可適用于凸出模塊的PCR儀，且移液過程中穩(wěn)定性高。

　　5、根據(jù)實驗選擇耗材

　　根據(jù)檢測方法的不同，耗材的選擇也不同。

　　PCR實驗分為普通PCR法和熒光定量PCR法。普通PCR法一般是終點(diǎn)PCR跑膠法測定，所以所用耗材的導(dǎo)熱性和密封性和實驗結(jié)果有著密不可分的關(guān)系;而熒光定量PCR是實時檢測熒光信號，除了導(dǎo)熱性和密封性外，對透光性和避光性也有所要求。

　　簡而言之，做熒光定量PCR的耗材也可以做普通PCR，反之則不行。

　　導(dǎo)熱性

　　導(dǎo)熱性越好越均一，PCR的速度就越快，準(zhǔn)確度也越高。

　　密封性

　　密封性越好，產(chǎn)物的揮發(fā)越少，得到的產(chǎn)物就越多，同時氣溶膠的產(chǎn)生也越少，對于下一輪實驗的污染也就越少，也就意味著假陽性的產(chǎn)生率越低。

　　避光性

　　這是針對熒光定量而言的，如果我們在整個實驗過程中沒注意避光，帶有熒光的試劑過度被消耗，那直接就會影響我們實驗的擴(kuò)增效率，導(dǎo)致產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果。

　　透光性

　　這也是對于熒光定量而言，我們知道它是一種實時定量的方式，那么耗材本身的透光性就直接關(guān)系到我們檢測到的熒光信號多少。如果選擇耗材透光性良好，需要檢測到的信號就會變得微弱，那就會造成我們對結(jié)果的誤判。所以對于熒光定量而言，白色PCR板效果優(yōu)于透明PCR板。

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